把微生物实验室缩成芯片大小,微流控让神奇发生!
杜文斌 | 热心肠智库专家 2019-11-21
时长:18:03 字幕:李琳 审校:蓝灿辉
什么是微流控,它们有哪些类型,带来哪些研究革命,解决了哪些菌群研究的痛点,会有什么应用?
杜文斌
中国科学院微生物研究所研究员
北京医学检验学会微生物与感染分会常委
毕业于浙江大学,博士学位,现为研究员,中国科学院微生物研究所维生素资源前期开发国家重点实验室分析微生物技术研究组组长。美国芝加哥大学化学系及动态生物物理研究所Rustem F. Ismagilov实验室博士后,2012年入选第七批"千人计划(青年项目)"、中国科学院"百人计划"B类。研究领域主要是微流控生化分析芯片及微生物学应用。发表SCI论文六十余篇。
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图文实录

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非常感谢大家,我是来自中科院微生物研究所的杜文斌,我今天给大家介绍的是微流控技术。

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首先什么是微流控技术?

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自然界是鬼斧神工的大师,其实也是一位微流控大师。

世界上最高的树是澳洲的杏仁桉树,高达156米,相当于50层楼房的高度。植物是怎样从地表将水输送到100多米的树冠呢?它依靠的是植物的蒸腾作用,植物的蒸腾作用呢,从表面上看它是叶片表面水分的一个蒸发的过程,实际上是一个非常复杂庞大的微流控的系统。

在植物的根系中,根毛将水分吸收并输送到根中的导管,再进入茎中的导管最后到达叶片中的导管,最终通过植物表面的气孔进行可控的释放。

植物的蒸腾作用不仅是一个可控的微流控系统,它有效地促进了植物的生长和营养的吸收,也为微流控的研究提供了一个非常好的素材。

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从植物回到人体本身,人体的血液循环也是一个非常复杂的系统,心脏将血液从动脉泵送到全身的血管,再从毛细血管输送到静脉回流到心脏。如果把人体的所有的血管连接在一起,其长度可以达到6万英里,这相当于赤道长度的2.5倍 。

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而人体的血液循环中最为精巧的是毛细血管微循环。在毛细血管中,它的内径只有5-10微米,血细胞将养分和氧气输送到全身的所有细胞,并将废弃的物质带走,这个微流控系统全天24小时不间断地运行来维持我们的生命。

如果大家仔细观察,其实生活中还有很多这种微流控的过程。

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简单的来说,微流控就是微尺度下面流体的精确控制和应用,微流控芯片的通道尺寸通常在百纳米到百微米级别,它的微型化带来了低消耗、自动化和功能集成的一系列的优势。

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和微电子技术相同,微流控的基础也是微纳加工技术,如果说微电子技术带来了信息化和数字化的革命,微流控技术有望在化学、生物、医学、材料和能源等等各个方面发挥重要作用,为大家提供一个全新的技术平台。

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微流控的发展发端于微电子学的发展。

50年代第一个晶体管研发出来开启了微电子学和集成电路研究的发展历史。

70年代出现的喷墨打印呢,实际上是微电子和微流体紧密结合的一个非常复杂的控制系统。

90年代以来随着分析化学家将微纳加工技术应用于芯片色谱和芯片毛细管电泳的研制,开启了微流控技术高速发展的30年。

而随着细胞和组织等芯片技术的出现,也开启了微流控技术全面应用和发展的一个新时期。

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那么如何制作微流控芯片呢?

微流控芯片的制作过程和我们手机里面的芯片的制作流程有类似之处。

首先通过硅片表面旋涂光刻胶以及使用掩膜的紫外曝光可以制作一个基于硅片的阳膜,在阳膜上可以灌注一种柔性的硅橡胶材料叫PDMS,然后通过PDMS可以制作一个PDMS的印章。

下图展示了一个微流控芯片加工的流程,通过在芯片上按照设计的通道结构制作硅片阳膜并灌注PDMS,在通道的进口和出口打孔并于底部的基片进行键合,即得到了一个微流控芯片。

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那么常规的实验室(包括样品的前处理、样品的纯化、富集以及最后的分析、反应和检测)通常有很多仪器、器皿,一项研究由很多人员共同完成的;而微流控芯片呢,能够将这些实验功能单元集成到一个邮票大小的芯片上面。

下图展示的是一个对全血中的生物标志物进行分析的集成化微流控芯片。

这个芯片采用毛细作用来进行流体的驱动,无需外部的一些流体控制,然后芯片上集成了一个基于免疫反应条码的疾病标志物检测区域,可以实现多种血流中的疾病标志物的同时检测。

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细胞芯片是一种用于生物学研究非常好的新模型,在细胞芯片上可以实现单一细胞或多种细胞的复合培养,并实现不同种类细胞的分选、裂解以及成像。

裂解的细胞可以通过芯片上的电泳或者一些色谱进行分离和分析,同时我们也可以在芯片上直接进行一个原位、成像的活体细胞分析。

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近几年器官芯片得到了一个非常快速的发展,器官芯片实际上是利用微通道构筑三维的器官或者说组织,然后利用器官芯片可以模拟大脑、脊髓、人的肺以及心脏等等。

器官芯片可以精确的反映人体内的微环境,模拟人体的微环境来为药物研发和个性化的用药提供指导。

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在微生物学研究或者说肠道研究为什么需要微流控呢?

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首先大家来看一下,传统的微生物学实验通常是借助于这种平板或者说试管进行的,同时需要一系列的显微成像和检测的手段与仪器,整个实验的流程比较烦琐复杂,同时需要消耗大量的试剂和时间。

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而宏基因组学可以不需要经过这种实验室的传统培养,直接揭示菌群的组成和潜能,但是微生物菌群在原位的功能以及如何发挥的作用仍然缺少直接证据。

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大家可以看一个菌群的结构,它是一个非常复杂的三维生态系统。

在一个地衣的生态系统中,细菌、真菌和藻类有机地生活在一起,形成一个非常复杂的三维生态系统,利用微流控芯片可以模拟自然环境中存在的这种微结构,来更好地模拟菌群的功能。

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比如说,这个是芝加哥大学的研究团队开发的一个用于人工构建稳定功能菌群的研究。

在这个芯片上,芯片包括三层,上层是细菌生长的一个独立微室,在微室内不同的微生物可以独立生长,互不干扰;在中间层是一层半透膜微生物分泌的物质,可以通过半透膜输送,同时能够从培养基中获得它所需要的养分;在下层的是一个微流控联通的通道,实现各个物种的交互。

在这个芯片上研究者构筑了一个三元的菌群,首先其中的一种菌株可以降解青霉素,使另外两种菌株生长的抑制得到解除;第二种菌株可以固氮来提供菌群生长所需的氨基酸;第三种菌株可以将培养基中的纤维素降解为葡萄糖来提供菌群生长所需要的碳源。

这样一个菌群能够实现稳态的生长,避免了传统的混合培养所造成的竞争抑制,为人工构建微生物组提供了一种新思路。

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2012年哈佛大学的研究团队开发了一种肠道芯片,在这个芯片上通过一个半通透的薄膜进行肠表皮细胞的培养,通过通道两侧气腔的周期性收缩和释放可以实现这个膜的伸缩,通过膜上下层的流动可以输送养分,并模拟食物在肠道内的流动。

这个芯片更好地模拟了肠道内流动的剪切力和周期性的蠕动,使肠表皮细胞能够进一步分化,并产生褶皱和绒毛的结构。

与传统的方法相比,它的比表面积以及它的结构能够更好地模拟肠道对于药物的吸收,可以作为一种药物代谢研究的模型。同时呢,研究者也在这个芯片上进行了微生物的群落培养,发现芯片上微生物群落能够跟肠道表皮的组织进行共生,所以说也为炎症的研究提供了一个非常好的模型。

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那么微生物菌群的数量庞大、种类繁多,它的样品非常复杂,所以带来了分离培养和检测的一系列难题。我们实验室聚焦于使用液滴微流控技术,实现超高通量的单细胞分析。

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如图所示的是一个典型的液滴微流控芯片,通过水相和油相的汇流,可以使水相切割成皮升至纳升级的微滴,每个微滴可以提供一个独立的反应器,这样可以将微生物细胞包裹在液滴里面,进行单细胞水平的培养和分析。

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我们开发了一套基于液滴微流控的高通量单细胞微生物组研究方案。

首先,利用我们的液滴生成芯片,可以生成皮升至纳升级的微液滴,每个微液滴可以包裹单微生物细胞进行有效地隔离和单细胞水平分析。

第二,我们通过一个液滴注入芯片,能够在液滴内进行多步骤的化学和生物学的反应控制,利用液滴的表面活性剂的稳定性,可以实现单细胞水平的培养和裂解。

最后,利用液滴的高通量的分选芯片,可以实现单细胞功能微生物的有效、快速地分选。

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利用这一个方案,我们在微生物的培养方面开发了基于液滴阵列的大规模单细胞培养系统。

首先,我们利用微流控芯片生成液滴并涂布到一个油相覆盖的平板上面,我们所采用的涂布轨迹类似光驱里面记录的轨迹,液滴能够形成一个紧密排布的螺旋阵列。

这样做的好处是:一方面能使这个液滴固定在一个稳定的位置,方便我们进行重复的观察;同时使这个液滴的提取变得非常简单,可以采用传统的方法进行提取和放大。

我们将这个系统应用于深海沉积物的培养,发现测序技术低估了原位微生物的多样性,利用微流控的液滴以及结合传统的琼脂平板培养,我们大大提高了低丰度物种的覆盖。

另外,我们和微生物所刘双江课题组合作,把这一液滴划板培养平台应用于白蚁肠道的微生物群落的研究,并将这一系统应用于除草剂污染的土壤中降解菌株的分选。

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微生物具有一个非常特殊的现象叫趋化,能够趋利避害,即能够定向地游向营养物质而远离有害物质,对于趋化作用的微生物分选一直是微生物学的一个难题。

我们开发了结合液滴微流控和层流微流控的集成化微流控分析芯片,通过层流的浓度梯度通道,将趋化微生物从菌群中定向地分离到趋化物的一侧;再通过液滴生成单元,将单细胞包裹到纳升级的液体中进行单细胞水平的培养。

这一芯片能够实现连续定量的趋化分析和分离,同时呢,能够大大地加快趋化微生物的分选速度。

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此外,如何从菌群中直接筛选具有功能的微生物一直是微生物学界的难题,传统方法往往需要消耗大量的人力和物力。

我们开发了一套基于液滴微流控的筛选流程,在这一流程中利用液滴生成芯片包裹单细胞可以制备百万级的,单细胞包裹的微液滴通过液滴注入芯片,可以向液滴中注入微生物作用的底物。

在这个例子中,我们筛选的是一个脂肪酶分泌的菌株,然后通过荧光激活的液滴分选,可以快速地将产酶微生物的液滴进行分选和回收,利用这一个分选平台我们实现了油田、酒曲、湿地以及热泉样品中产脂肪酶微生物的高通量分选,得到了40多株具有产脂肪酶活性的菌株。

这一技术和现有的技术方法相比,我们分选的通量可以达到2000个液滴每秒,同时我们筛选的准确性可以达到99%以上,实现了超高通量、超低成本的筛选。

目前我们也在将这一系统拓展到塑料降解微生物以及生物质高效利用微生物的这些筛选中。

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单细胞扩增和测序是宏基因组测序的一个有效的补充技术,我们基于流式细胞和液滴微流控技术开发了一套面向单细胞扩增和测序的流程。

在这一流程中,我们可以使用传统的流式细胞分选进行单细胞水平的选择性分选,分选得到的单细胞利用我们自主研发的微液滴加注技术,实现纳升水平的反应。

我们和北京大学黄岩谊教授课题组合作实现了微生物的纳升水平的分选、裂解和全基因组的扩增。

这一平台被我们应用于深海沉积物的微生物的单细胞扩增和测序,获得了大量的微生物全基因组,也揭示了这些微生物的功能。

这一平台能够兼容流式细胞分选,同时呢,没有芯片耗材,可以大大降低单细胞测序的污染,我们能够将污染的概率控制在5%以下。

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此外,对于目前采用的测序和PCR等技术很难实现菌群绝对丰度的定量,我们开发了一套一体化的微滴数字PCR仪。

这一仪器利用多通道自动移液装置,实现自动化的样品移液;通过振动液滴制备技术实现纳升均一的液滴制备;通过温控扩增和检测实现原位的自动化扩增和检测。

这一系统能在菌群的绝对丰度定量、病原菌的检测、肿瘤的健康管理、以及遗传性疾病的检测方面都有希望发挥很重要的作用。

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我们实验室将致力于为微生物组研究和应用提供微流控平台。

一方面利用微流控的分离筛选能力可以实现超高通量的单细胞培养、测序和分选;另外一方面利用微流控的快速检测能力、精准检测能力实现病原菌的现场检测、数字PCR的定量检测、药敏分析、生物被膜的研究以及组织芯片和微生物组互作的研究 。

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最后我希望和学术界及产业界共同推动微生物技术的产品化、转化,我们希望借助于微流控技术面向基因检测和精准分选的技术平台,开发为微生物的检测、肿瘤的诊断、生物制药和食品药品安全的检测等提供新的解决方案,为高端仪器的制造助力,为生物医药检测服务。

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最后感谢各位,谢谢!

 

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