许兴国:一手菌群,一手肿瘤免疫,Ion Torrent 在进化!
热心肠小伙伴们 08-31
详解Ion Torrent 如何通过多生物标记物探索菌群,如何通过TCR测序免疫治疗的有效性和不良反应。

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主持人,各位同道,各位老师,大家好。我是许兴国,Thermo Fisher科技中国,在基因科学与临床测序试验大中华区的销售高级总监。

很高兴今天有这个机会,到这个地方跟大家一起探讨有关肠道的一些很有趣的故事。今天看到很多我们的同事、前同事,大家齐聚一堂,在这个很特别的场合里面,我们来讨论一下微生物组测序相关的话题。

我今天跟大家分享的题目是:见“微”知“组”——Ion Torrent助力微生物组及免疫组库的研究。

我今天的内容会针对在微生物组跟免疫组库两个大题里面。

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肠道微生物的研究,这几年来一直都是非常大的一个研究热点。

很多的研究都揭示了肠道微生物跟多种疾病相关,特别是肿瘤。当然,今天的肠道大会我们看到很多会场都跟食品、健康食品有很多的挂钩,但是我的话题会更挂钩在科研,以及在临床的肿瘤研究上面。

对于肿瘤研究来说,这几年,肿瘤的免疫治疗是一个非常热门的研究领域。到目前为止,在全中国至少有超过800家以上的免疫治疗的研究单位跟公司。在2017到2018年两年之间,陆续有非常多这方面的相关研究在《Science》、《Cancer Therapy》上发表。

肠道微生物跟免疫治疗的疗效事实上是非常息息相关的,其中也包含了免疫相关的不良事件。

为了更好的理解肠道微生物跟免疫组库的一些影响,所以我们需要更多的研究,我们需要更多透过多生物的标记物,这样的研究方案来揭示这样的一个谜底。

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在过去呢,我们对于肠道微生物只知其然不知其所以然,肠道微生物,各式各样的微生物非常的复杂,而我们对于它们就像所谓的管中窥豹,我们只知道一点点的面相。

当然,仰赖于这几年非常非常多的分子生物学的技术进步。所以我们在这里说,多生物标记物的一个研究方案,就借助了过去很长久的分子生物学的一些发展,让我们的研究者不再管中窥豹。

结合目前的肠道微生物跟免疫组库的一些研究,我们就可以见“微”知“组”,也就是我们看到微生物,不再是看到一个一个的微生物,而是看到整个组学,直通谜底。

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那我们现在谈谈这个肠道微生物吧。从肠道微生物的研究来讲,为什么我们需要所谓的多生物标记物这样的一个研究方向?

因为整个多生物标记物的研究方向,能够让我们知道整个在微生物菌群里面,哪些科、属、种,甚至到所谓的菌株,构成了整个肠道的微生物生态环境,也让研究者能够知道这些微生物它特别对于抗生素的这些耐药性以及敏感性的一些特性。

就像上面我们看到的这张图,这是一个结核分枝杆菌的所有SNP的一个图谱。

从这个基因图谱的序列图可以看到,蓝色的这个区域这些SNP,就是跟抗生素耐药相关的一些SNP的位点。

同时,在这样的一个分析里面,可以让我们探究它跟整个人体免疫系统之间的相关性。

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为了达到这样的目的,我们就必须要一个测序准确,而且测序读长较长的一个实验研究平台,一个这样的NGS平台。什么样的NGS平台能够同时符合所谓的测序准确,以及测序读长较长呢?

Thermo Fisher scientific的Ion AmpliSeqTM这样的一个技术,是基于超高多重PCR的靶向捕获技术。

这个技术能够让使用者用非常低的,低到10个nanogram的DNA跟RNA这样少量的样本,就能够开展所有相关的研究。

而我们有非常多的商业试剂盒,所有的引物呢都通过非常多的实验优化,并且可以设计相对比较长的一些扩增子。

这些特点能够让我们的使用者透过靶向测序这样的一个方法,把他们研究领域,特别是存在测序难度的区域,以及低丰度的序列信息,能够透过这样的一个技术平台得到改善。

对于肠道微生物的研究来说,Ion AmpliSeqTM技术也提供了一个设计非常严谨的panel,比如说我们的16s高变区的试剂盒,能够帮助研究者在肠道微生物研究里面得到更多讯息。

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在这里跟各位分享一个文献。各位都知道,在自然界所有的微生物它不会是单一存在的,通常都有非常复杂的微生物系统。这是一个来自加州大学的研究,看左边的这个图,我们的使用者从自然界找了9种最常见的微生物。

我们利用两个方法来做比对实验,第一个方法,我们是把每一个单一的微生物,先做DNA萃取,做菌株的16s V4高变异区的扩增,然后再把所有的扩增子集合之后去做测序;另外一个方法,是把9种萃取完DNA的样品全部混合之后,再去做16s V4高变区的扩增,然后再做测序。两个方式去模拟更多的这个状况。

仪器平台总共选择了两个,一个是Thermo Fisher Ion Torrent的PGN,另外一个是非常值得尊敬的友厂的仪器。

那我们看右边的这个结果,这是一个非常有趣的结果。我们刚说过了这是一个9个微生物混样测出来的结果。

你看到绿色的部分,用Ion Torrent平台测出来的就是绿色的这个区域,它更能够真实地反映所有样品的状况,也就是它找出来的微生物其实比原来实际的9种稍微多一点点。

可是你看到红色的这个区域,不管是单边读长或是双边读长,它跑出来的这个数据高达100多个。也就说,我们这样的一个测序平台,即便都是所谓大家认为非常优秀的NGS平台,在这样的一个微生物混样的检测过程当中,事实上会有很不同的结果。

所以这个专家最后做了一个结论,就是无论是gDNA的混样标准品,还是PCR扩增子混样的标准品,Ion Torrent测序都能够带来更为精准的分析结果。

这是加州大学的一个结论,所以这就是测序的准确性,特别是在所谓的SMP level的测序准确性,对于微生物组学研究来说,是非常非常重要的。

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刚才讲了一些微生物的一些研究方案,我们刚刚提到另外一个很值得大家去注意的,是所谓的免疫相关的研究。

我们来看一下免疫组库这一块,我们主要介绍TCR,也就是T Cell Receptor(T细胞受体)的测序。

各位都知道,在中国目前有超过800家企业投入了免疫研究跟治疗,而大部分的医院现在不管是实体瘤或血液瘤都做非常多的免疫治疗。

所以如何能够针对免疫治疗相关的一些内涵了解得更多,这是非常非常重要的。透过T细胞受体的测序,不管是血液样品或者是组织样品,我们可以了解T细胞组库的一些讯息。对于肿瘤的免疫治疗而言,这个讯息可以帮助我们的研究者更准确的预测免疫应答,也就是这个免疫治疗有效或无效。这个免疫应答是非常重要的。

同时呢,我们可以评估可能发生的免疫相关不良事件,也就是要知道这个免疫治疗的一些后续不良反应。对于CAR T细胞治疗的过程而言,这个技术可以在整个生产环节的每一个阶段,对T细胞进行不断的评估,而优化我们的过程。

赛默飞对于这样的研究需求,也开发了一个商业化的panel,针对全世界第一个拿到FDA的Oncomine为基础,我们开发了一个叫做Oncomine TCR Beta-LR Assay,专门针对这样的研究。我们只需要50个nanogram到1个microgram的外周血RNA,就可以开展这样的一个研究。

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我们来看一下,这个TCR Convergence怎么样可以增加我们测序的准确性。

对于TCR测序来说,测序的准确性,特别是SNP测序的准确性至关重要。那在这里呢,我们提到的就是所谓的低碱基取代的错误率。

我们来看一下这个左边的这张图,你可以看到Clone 1、2、3,事实上在碱基的序列里是不一样的,至少你可以看到在三个地方,它是不同的碱基。但是因为密码子简并性的存在,部分这些不同的碱基序列的DNA序列的Clone,虽然在DNA层次上有序列的不同,可是在氨基酸层面上却是一样的,这也是我们所谓的TCR Convergence这样的一个想法。

所以说我们需要一个非常准确的所谓的低碱基替换错误率的测序技术平台,来确保我们不会有所谓的误解,我们能够真实的反映每一个真实的TCR的序列。

同时,对于肿瘤而言,肿瘤的新生抗原所激活的T细胞也一样会发生这样的问题。也就是说在DNA序列是不同的,但是因为密码子简并性的存在,它得到了同样的一个氨基酸的序列。

所以相对只看氨基酸序列的免疫组和Clone的扩增,用我们这样的TCR Convergence来评估所有T细胞组库的多样性,这个噪音更小,更能够真实反映TCR的真正的构成,因此可以用来优化免疫应答的标志物。

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在免疫应答的研究过程当中,我们知道很多公司都开展了肿瘤突变负荷(tumor mutation burden)这样的一个研究,以此来进行免疫治疗疗效评估。

而TCR Convergence,我们说过它是一个更好的免疫应答预测的标记物。为什么呢?这相对于tumor mutation burden,我们有以下的一些优点。

让我们来看一下这个图,它至少存在三大优势。第一个呢,它可以检测出非同义突变以外的变异带来的影响,也就是说患者自身的DNA序列改变之外的因素所造成的影响。

我们看一下右边这张图,它包含了翻译后的修饰突变,异位基因表达,RNA层面剪切的缺陷,自体抗原,以及外来的病毒等等,这些都会影响T细胞的激活,而这些讯息都不能够在肿瘤突变负荷这样的一个技术平台里面能够看得到。

那另外两个比较大的优势,它是一个基于直接的实验结果而建立的免疫应答评估模型;最后就是,它可以实现液体的活检。

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再来跟各位介绍一下加州大学旧金山分校的一个研究,它的题目是《探索更优化的肿瘤免疫治疗策略》。

这个研究员利用TCR evenness和TCR convergence这两个TCR的多态性指标,选择了22个接受了抗CTLA-4单药治疗癌症患者,并且按照有免疫应答跟无免疫应答这两种疗效来做样本的分组。

可以看到,右边是这个研究的结果。从这个结果来看,不管是灵敏度或者是特异性上,相较于单独使用TCR evenness,或单独使用TCR convergence,两个合在一起的指标更能够有效地提升对于免疫应答的预估效果。

各位可以看一下,右上角这个蓝色的曲线,是远远高于其他红色跟绿色的曲线。这个研究成果已经在2018年正式的发表了。

谈完有关于免疫应答的部分,我们再来谈谈免疫不良反应。T细胞受体的多态性也能够用来预测免疫治疗所带来的相关不良反应。各位都知道免疫治疗是一个新兴的治疗方法,所以有很多不良反应事实上是相当相当严重的。

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这是在2018年发表的一个研究。作者针对55个接受免疫治疗且产生不良反应的患者,进行了T细胞受体的测序分析,用的也是Ion Torrent平台。所有的患者都是白人。

经过精准测序的结果,研究人员可以获得每一个患者的T细胞受体β链的单倍型讯息。透过单倍型讯息的序列分析,可以把所有病人分成四组,各位看中间的这个图谱,可以看到很明显的1、2、3、4,四组。

作者发现,在这四组里面,可以看到第2组有20个不良反应都是在Grade 1-2,也就是说轻微的不良反应;而第1组有9个轻微的,有4个严重的;在3、4组,都表达了不同程度的严重不良反应。

也就是说透过低SMP测序错误的精准测序平台,可以把基于T细胞受体单倍型不同的病人实施分类,提供我们在整个细胞治疗的过程当中,做一个很好的参考。

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最后我们来介绍一下Ion Torrent高通量测序技术方案。

Ion Torrent的高通量测序方案就是一个高SMP检测准确性很高的测序平台。它能够提供单端目前最长600 base pair的测序。这个性能能够很好的满足微生物16s的分析,以及免疫组库的分析需求,而且我们配套了很多商业试剂盒。

所以赛默飞能够很好地帮助研究者开展整个微生物菌群的研究,以及肿瘤免疫治疗相关的免疫应答及不良反应的研究,让工作更为便捷,更为精准。

同时,我们也不断的推陈出新,继续提供很多各式各样的实验方案,来满足各位老师的需求,这是赛默飞一贯的宗旨。

我们不是一个提供仪器平台的公司,我们是提供整体解决方案,想客户所想,帮客户解决客户所要解决的问题。

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这就回到了我们整个公司的愿景:我们携手我们的客户,一起让这个世界healthier,cleaner and safer.

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谢谢各位,谢谢。


许兴国
赛默飞世尔科技(中国)有限公司 战略客户部高级总监
An experienced operational executive who has delivered the capability in total management, including intensive R&D activities, highly competitive sales, international market survey, secured manufacturing in clean room and GMP factory, involvement in Steel, Cement, coal and mining, material characterization and advanced analytical platform, safety & security, teams leading of professionals and new business planning & development. Proven ability to excellent facilitative, collaborative skills and work with cross-functional skate holders. Excellent oral and written communication performance and creative thinking with strategic vision.

一位经验丰富的执行总监,拥有很强的综合管理能力,包括强化研发活动、富有竞争力的销售、国际市场调研、确保净化室和 GMP 工厂的安全生产,参与钢铁、水泥、煤炭、矿业的材料特性分析,致力于搭建先进、安全以及精准的分析平台,专业的团队领导,专注于新业务的规划与发展。具有优秀的协作能力以及跨部门合作能力,优秀的口头与书面表达能力, 拥有具有战略性眼光的创造性思维。
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