2月4日，Nature Biotechnology 上线了华大基因团队的最新研究论文，在猪年的第一期热心肠日报中，我们特别进行了解读：
华大基因团队：1520个人肠道单细菌参考基因组，助力菌群研究
Nature Biotechnology [IF:35.724]
① 用培养组学分离>6000株人粪便细菌，得到1520个高质量单菌基因组草图（338个种），构成可培养基因组参考（CGR）数据集；② 包括人肠道的主要细菌门和属，含至少264个新参考基因组，有不少低丰度菌，丰富了现有参考基因组，提高了宏基因组学分析的分辨率（读段比对率和SNP分析等）；③ 对CGR的功能注释加深了对肠道菌功能的认知；④ 对38种重要菌的泛基因组分析，揭示不同菌门的泛基因组开合趋势和在各自核心和非核心基因组上功能富集的差异。
1,520 reference genomes from cultivated human gut bacteria enable functional microbiome analyses
02-04, doi: 10.1038/s41587-018-0008-8【主编评语】华大基因的肖亮、贾慧珏和李俊桦与团队的重要研究，今天在Nature Biotechnology发表。该研究通过培养组学方法，从健康人粪便样本中获得1520个单菌基因组草图，对现有的人肠道细菌参考基因组有很大补充；并通过功能注释和泛基因组分析，加深了对不同肠道细菌的功能和特点的了解。这些成果将助力人肠道宏基因组学分析和相关应用转化研究，值得专业人士仔细阅读。（@李丹宜）
今天，我们特别编发对华大基因团队的专访，请他们详细介绍团队、研究细节、科学意义和近期类似研究的思考。
以下是采访内容，提问者是热心肠小伙伴们，回复者为华大团队：
答：这篇文章一共31位作者，在这篇文章的前后工作中有着不同的贡献，其中核心作者主要有3位通讯作者和5位共同一作，他们各自的贡献为：
肖亮博士，文章通讯作者，主要负责项目的启动、文章的整体设计、文章数据和结果的分析与讨论、文章的修改以及文章的通讯联系；
贾慧珏博士，文章通讯作者，主要负责文章初稿的撰写、文章框架的搭建以及相关结果的分析讨论；
李俊桦博士，文章通讯作者，主要负责文章的设计，推进文章主要结果的进展及相关结果的分析讨论；
邹远强博士，文章的第一作者，主要负责菌株厌氧培养平台的搭建，菌株的分离鉴定，后期文章框架的搭建、所有数据结果的分析、文章撰写以及文章的修改；
薛文斌，文章的共同一作，主导项目设计，前期样品收集、菌株培养条件的设计，菌株测序及分析，后期文章主要框架的搭建，文章初稿的撰写，重点结果部分的讨论；
罗广文博士，文章的共同一作，主要负责菌株基因组分析设计开发工作，包括全基因组组装和拆分，物种注释，进化树构建，基因集比对，基因功能分析比较等多项生物信息分析工作；
邓子卿博士，文章的共同一作，主要负责文章的撰写修改，KEGG和9大功能的数据分析以及相关图表绘制；
秦盼盼，文章的共同一作，主要负责泛基因组部分方法的建立，38个物种泛基因组分析以及功能相关结果的整理。
目前团队核心人员共7人，其中博士学历3人，海外高端人才2人，主要包含细菌基因组数据挖掘、功能分析，益生菌产品开发等相关方向的人才，旨在基于前期的数据发现将潜在应用价值的新型益生菌进行产业转化。
答：我们团队一直致力于将宏基因组，特别是肠道宏基因组的科研成果向应用方向进行转化，其中很重要的一方面就是肠道来源细菌的功能研究和新型益生菌（也被称为二代益生菌）的开发。
此次细菌菌株库和肠道细菌参考基因组数据库的建设工作就是我们这个方向上很重要，很基础，也很必要的一项工作，接下来，我们将围绕菌株库资源，在功能菌株临床转化方面重点进行突破。
近年来，除了菌株库和基因组数据库累积的成果，我们还结合疾病相关的宏基因组研究，发现了很多潜在的可用于疾病（包括IBD、肥胖、糖尿病等）干预的菌株，也分别进行了专利申请；
同时我们也在菌株的功能挖掘方面也在不断积累，尝试逐步打通从宏基因组，单菌基因组功能到疾病的干预应用的科研-产业链条。
答：首先这项研究是基于纯培养技术积累大量的有价值菌株资源，发现不少新的物种，这些物种大大增加现有数据的多样性。
与此同时充分利用华大测序优势，构建了这么大的参考基因组数据集，填补现有肠道菌群研究中细菌参考基因组不足的情况，对于宏基因组分析也提供了更多参考数据。
另一方面基于单菌基因组，我们在这批数据中分别在Reads和基因水平、SNP方面进行了分析，发现我们CGR对现有数据具有显著的补充和提升。
另外，我们也首次进行了大规模的泛基因组分析，分析了38种肠道菌的Core基因和Pan基因的分布情况。
在泛基因组的分析部分，我们也发现了一些比较有意思的结果，比如拟杆菌的泛基因组趋势更加开放，放线菌相对闭合。
在产丁酸的功能方面，普氏栖粪杆菌、直肠真杆菌等产丁酸的通路基本分布在核心基因组上，这也进一步反应了这类物种在一些特定功能具有保守的特点。
本篇文章中，我们对于菌株库的物种进行了分析统计，通过与2014年基因集（ICG，发表在NBT）的属水平的分类进行比较，发现了基因集很多低丰度（低于1%）的物种在我们菌株培养的结果中有很多数量菌株，而且有9个属是基因集数据里面没有包含的，这也反应了培养的方式可以获得低丰度，甚至宏基因组分析难以发现的微生物。
答：在我们整个过程中遇到的最大的问题是在细菌分离培养这块儿，细菌培养是非常大的工作量，也是一个比较重复、枯燥的过程，而且经常会遇到细菌培养污染、死亡的情况发生。
对于肠道里的细菌来讲，可能还需要面临更大的挑战，那就是严格的厌氧环境。
这也需要我们实验人员不断去总结经验，首先在厌氧平台的搭建方面，考虑到很多肠道细菌的生长对氧气比较敏感，我们从培养基制备，厌氧操作，菌种的储存等各个环节都注重厌氧环境的维持，这也是整个活菌操作的核心。
当我们看到分离的肠道菌的种类越来越多，新菌越来越多的时候，我们也逐渐看到了我们的成果的价值了，也正因为有了这个工作作为基础，我们才有可能去积累更多新的数据。
答：目前在整个菌群领域的转化方面，大多数还是基于菌群检测以及传统的益生菌、益生元干预，我们的这项研究，可以提供更多的肠道细菌资源（也包括传统的乳酸菌），都是来自于健康人体中常见的种类，同时也提供了基因组和功能的数据。
其中包含的新型益生菌将成为下一阶段益生菌转化的重要方向，这也是我们团队接下来重点探索的方向。
答：以上我们也提及到，我们积累了大量的疾病宏基因组数据和菌株资源，接下来，菌株的转化应用将是我们主要的研究方向，我们有像上海瑞金医院这样在内分泌领域具有雄厚实力的合作单位，接下来会针对临床应用的菌株会进行更多的探索。
在我们不断进行菌株库扩充的同时，我们也结合前期的疾病宏基因组数据，我们能够找到一些与宿主健康相关的潜在益生菌株。
一个具体的例子，2012年华大发表在Nature的一篇二型糖尿病和肠道菌群关联的研究，发现一个未知MLG（宏基因组连锁群，metagenomic linkage group）在对照人群中富集而在疾病人群中丰度显著降低，通过和我们现在的菌株基因组数据比对，发现了一株序列高度相似的新菌（隶属于毛螺菌科的新属）。
通过对这株新菌进行体外功能（具有产短链脂肪酸的功能）以及小鼠模型的验证，我们发现其能够显著改善糖尿病小鼠的代谢指标，有望开发成为新型益生菌进行二型糖尿病的干预。
这个结果令人振奋，也从另一个角度体现了我们菌株库工作的巨大价值。
答：一方面基于宏基因组技术对于疾病的解析还不够深入，这也需要多组学和大队列获取更多精确性信息，结合有效的模型进行验证，这样得到的结论才能更加可靠。
另外菌株层面的研究仍是我们进行菌群研究需要坚持的，从我们的数据里面也能发现很多物种在菌株层面还是存在比较明显的多样性，菌株之间的差异可能会表现在功能方面的差异。
通过大数据的关联分析，结合菌株层面的功能验证，从单一的菌株到整个菌群生态系统的影响也是我们需要进一步突破的方向。
菌群研究归根结底是要为人体健康提供更多的指导，为疾病提供更多的干预手段，因此转化应用也将是接下来菌群领域的一个热点。
目前粪菌移植作为微生态临床应用一个热门的治疗方式已经在很多类型疾病上取得了成效，但精准到菌株水平的功能发挥对于疾病的影响仍需我们去深入探索。
这又回到了活体菌株的这个方向上了，相信最终能够解决问题的是移植供体肠道中有效菌株组合的Cocktail，这也是接下来我们需要深入研究的方向。
问：能否讲一下Culturable Genome Reference (CGR)参考基因组集的数据共享情况？
答：目前我们的CGR数据和菌株资源是完全对外共享的，基因组数据保存在国家基因库数据归档中心（CNSA，project id：CNP0000126），具体的链接是： https://db.cngb.org/cnsa/project/CNP0000126/public/ 可供大家随时下载。
所涉及的活体菌株我们也可以以科研的形式对外共享，具体可以联系国家基因库的工作人员：cngb-ebb@genomics.cn。
问：这项研究对CGR的1520个肠道细菌基因组进行了功能注释，加深了对肠道菌群及其成员的功能的认知，你们觉得其中最有价值的发现是什么？
答：功能层面，我们结合先验知识和我们数据的情况进行了系统的分析，分别从KEGG常规功能和其它9项有益有害的功能的分布进行了归类，发现拟杆菌作为肠道中比较大的门类，其在胆盐水解酶、β-半乳糖苷酶、必须氨基酸和维生素的合成等对人体有益的功能具有很大潜力，也进一步反映了拟杆菌对人体微生态的重要性。
另一方面，通过这些功能分析，我们可以发现我们菌株中新的潜在益生菌或致病菌，为菌株的应用提供更多的参考数据，当然这些功能的数据也支持我们进行菌株后续的代谢模型研究和功能网络分析，充分挖掘菌株数据的价值。
问：泛基因组分析表明，拟杆菌门细菌似乎有更加多样化的基因，而放线菌门的细菌基因组整体上更加保守，你们觉得造就这种差异的原因可能有哪些？
答：首先从肠道中拟杆菌和放线菌所占比例来看，拟杆菌门的比例高于放线菌，其次，从2个门所包含的物种来看，拟杆菌门的物种多样性也高于放线菌，尤其在我们这批数据中，拟杆菌门发现的新物种也是比较多的，因此拟杆菌的基因组会更加开放一些，可能拟杆菌在进化过程中发生着更加频繁的水平基因转移现象，导致了其在进化过程中可以获取更多外源的基因，在这部分目前还没有很深入的分析，也欢迎相关领域的专家一起来深入探讨。
Cell：探索全球人类微生物组中的广大未知
Cell [IF:31.398]
① 对涵盖不同年龄、地域和生活方式的9428个人体宏基因组进行组装，获得4930个物种、154723个微生物基因组；② 77%的物种是未知物种（uSGB），大大扩展了人类微生物组多样性和参考基因组，使粪便样本中匹配到参考基因组的宏基因组读段从67.76%提高到87.51%；③ uSGB在样本中普遍存在，主要来自非西化人群，有些uSGB包含上千个基因组，鉴定出一些常见的肠道uSGB，并扩展了细菌和古菌门；④ 注释了285万个基因，许多与婴儿发育或西方化等相关。
Extensive Unexplored Human Microbiome Diversity Revealed by Over 150,000 Genomes from Metagenomes Spanning Age, Geography, and Lifestyle
01-17, doi: 10.1016/j.cell.2019.01.001【主编评语】Cell发表的一项微生物组最新研究，对32个国家不同人群、生活方式、年龄段和身体部位（粪便、口腔、皮肤和阴道）的9428个人体宏基因组进行大规模组装，发现了大量的未知微生物物种和基因组，使人类微生物组的参考基因组规模翻了1倍，大大扩展了人们对人体微生物组多样性的认知，将为后续研究——特别是在菌株水平的肠道和口腔微生物组研究，提供很大的助力。（@mildbreeze）
答：最近发表在Cell的文章也是提供了大量的参考基因组数据，也发现了大量的新的物种，丰富了人类微生物组的多样性，这的确为人体微生物组分析提供非常丰富的数据，这方面确实跟我们数据有一些共通之处。
从数据量来讲，这篇文章比我们提供的数据要多，但是直接对meta进行单菌的组装和拆分，一方面无法获得高质量的基因组数据，另外组装出来的单菌基因组是不是真实存在菌株也很难评估。
我们也会对他们的数据进行分析，最简单的，先评估一下文章中的某些“新”物种是否已经包括在我们的菌株库中。
我们提供的CGR则通过细菌培养然后测序获得的基因组数据，是真实存在的，基因组完整度相对比较高，同时我们也进行了功能层面，SNP以及泛基因组等方面的分析，系统的阐述的单菌基因组的价值。
宏基因组数据层面的分析和发现，有重要的指导意义，但也始终存在着诸多的局限性。
越来越多的研究者已经认识到，要真正将人体共生微生态研究深入下去，并体现其潜在的应用转化价值，菌株层面的多组学功能研究将是必不可少的，可以预见这一领域将是未来的热点之一。
我们也很期望我们的菌株（基因组数据）资源，能为这一领域的研究者提供有力的支持，能为人体共生微生态从科研走向应用贡献力量。
华大结语：
肠道微生物的研究持续受到不同学科领域研究者高热度关注，高水平的研究成果也经常带给我们新的启发，宏基因组测序技术确实能帮助我们发现这套复杂的生态系统与人体健康的关系，但是最终需要去验证机理，去进行疾病干预还是需要活体菌株。
细菌培养工作是接下来进行菌群深入探索和产业孵化关键的工作。
法国马赛大学Didier Raoult早些年提出的Culturomics的概念早已给我们建立起菌株培养的模范，针对中国这个复杂的菌群结构进行菌株培养工作是十分必要的，当然国内也有不少研究者也在构建各自的菌株库。
希望我们这项成果共享的数据资源能够给大家更多的帮助，也非常欢迎不同领域的专家与我们齐力协作，争取能有更大的发现，能够解决更多的人体微生态的问题，尤其是在下游的应用转化方面更加需要临床、药学、发酵等各方面的专家一起参与，这样才能实现菌株更大的价值。
